生物对壁画的危害——黄杆菌使敦煌壁画中红色颜料变色机理的研究

　　引起石窟壁画颜料变色的因素很多，初步调查和研究发现，霉菌的繁衍生长过程也可使壁画颜料产生变色。因为敦煌壁画颜料中掺加有胶结材料，这是霉菌生长的基本条件。经调查，莫高窟被污染的壁画约有百余平方米。危害这些壁画的霉菌主要为芽孢霉，黑曲霉，青霉等，这已经被我们在实验室里所证实。
　　铅丹的变色现象早已引起科学家们的注意，认为壁画上Pb3O4直接氧化成PbO2，就会发生如下反应：
　　Pb3O4(2Pb(2+)O+Pb(4+)O2)→3Pb(4+)O2
　　但是从Pb(2+)→Pb(4+)的偶电位来看，在通常情况下该反应是不可能发生的。我们认为高湿度是各种环境因素中影响Pb3O4变色的最主要的因素，但光照对Pb3O4变色的影响也是不可忽视的。铅丹在高湿度条件下(RH70％)，经荧光照射变色非常快，而在RH48％时，用同一光源照射相同时间后几乎不变色。并且尽管颜料中蛋白胶完全老化前对铅颜料的变色起防护和阻滞作用，一旦蛋白胶老化后，就会大大加快Pb3O4的变色反应。所以，我们认为壁画上的铅丹在高湿度条件下不是直接生成棕黑色的PbO2，而是先生成铅白[2PbCO3·Pb(OH)2]，铅白进一步变色生成PbO2。反应如下：
　　Pb3O4(2PbO+PbO2)+H2O+O2→2PbCO3·Pb(OH)2 (1)
　　2PbCO3·Pb(OH)2+H2O+O2→PbO2+CO2+O2 (2)
　　反应(1)较易进行，而从铅白生成二氧化铅就困难得多了。意大利S.Giovannoni经过十年的工作证明，壁画地仗中的消石灰在它吸收空气中的CO2完全变成中性钙之前，可作为铅丹变色反应的活化剂。进一步实验表明，在碱性条件下和高湿度环境中，一些氧化剂如H2O2，可诱发铅白氧化生成PbO2。壁画在高湿度条件下，掺在壁画颜料中的有机胶结材料上易繁殖霉菌等微生物，它们在代谢过程中产生的光敏性氧化剂及H2O2能对铅白的变色反应起催化作用，同时微生物也可使(2)的变色反应容易进行而生成PbO2，因此莫高窟壁画中的铅丹的变色过程是：
　　Pb3O4→2PbCO3·Pb(OH)2→PbO2
　　由此可见微生物、H2O、强碱性地仗在铅丹的变色过程中所起的重要作用。但目前微生物对壁画的破坏作用的研究，大部分着眼于霉菌对壁画的污染上，关于微生物影响敦煌壁画颜料变色工作还进行得很少。敦煌研究院和兰州大学生物系合作，从敦煌壁画上分离到一株能将铅丹氧化成PbO2的细菌，并对其生理生化特性、氧化Pb3O4机理及其在壁画上的生长抑制方法，进行了较深入的研究，这对敦煌壁画的科学保护有重要意义。
　　(一)材料与方法
　　1.菌种
　　分离纯化自敦煌莫高窟第205窟变色壁画表面。
　　2.培养基
　　(1)牛肉膏液体改良培养基(W／％)
　　牛肉膏0.3g，蛋白胨1.0g，葡萄糖0.5g，核黄素5×10(-6)mol／L，NaCl 0.5g，MgSO4 0.02g，蒸馏水100mL，pH8.2，121℃灭菌20min。
　　(2)牛肉膏琼脂培养基(W／％)
　　牛肉膏0.3g，蛋白胨1.0g，琼脂1.6g，NaCl 0.5g，MgSO4 0.02g，蒸馏水100mL，pH8.2，121℃，灭菌20min。
　　(3)加铅琼脂培养基(W／％)
　　牛肉膏液体改良培养基中加琼脂1.5，CaCO3 0.2Pb3O4 0.02。
　　(4)加铅液体培养基(W／％)
　　牛肉膏液体改良培养基中加CaCO3 0.2，Pb3O4 0.02。
　　(5)菌种鉴定用培养基(W／％)
　　葡萄糖发酵用培养基，IMVIC与硫化氢实验用培养基。
　　其他理化鉴定所用培养基，其中休和利夫森二氏培养基改用1％中性红作指示剂，pH8.2。
　　3.试剂
　　Rnase A(华美)、蛋白酶K(华美)、SDS(华美)、溶菌酶(华美)、TEMED(Sigma)、NBT(上海前进试剂厂)、VB2(上海化学试剂厂)、Met(北京化工厂)。
　　4.实验方法
　　(1)菌种形态及生理生化特性
　　①菌体形态的电镜观察
　　镜电切片的制备：在牛肉膏培养基上培养菌体，收集菌体，重蒸水洗2次；挑出小块菌苔，投入3％戊二醛中固定(4℃)2h；PBS缓冲液洗3～4次；1％锇酸后固定2h；PBS缓冲液洗3次；30％→50％→70％→83％→95％→100％乙醇脱水；环氧丙烷过渡30min；环氧丙烷：环氧树脂3：1，1：1，1：3；纯环氧树脂液浸透48h；包埋：(Epon812 13mL DDSA8mL，MNA7mL，DMP-30 10～12滴)；聚合；修整；制作超薄切片；醋酸铀单染15min；TEM观察。
　　②细胞大小测定，革兰氏染色，芽孢染色，菌落特征
　　荚膜染色
　　采用套染法，Ⅰ液→小滴于载玻片上→少许菌苔→均匀涂片→风干→Ⅱ液1～1.5→水洗脱色→晾干观察。
　　鞭毛染色
　　新鲜斜面加2mL无菌水接种。28～30℃培养15h。取样→滴一滴于载玻片上竖起风干→A液5～10s，弃染液→风干缓洗→风干，B液覆盖，火焰加热→冲洗→风干→观察。
　　耐盐实验
　　配制含NaCl 2％、4％、6％、10％、15％、20％和25％的牛肉膏改良培养液。灭菌。以不接菌为对照，接种，28℃培养5d。
　　需NaCl实验
　　配制无NaCl牛肉膏琼脂培养基，制成斜面、接种、观察生长情况。
　　明胶水解反应
　　穿刺接种，20℃温箱培养14d，观察。
　　酪蛋白水解
　　淀粉水解，培养4d。
　　纤维素水解
　　采用试管法，28℃培养7d。
　　氧化产酸
　　用1％中性红作指示剂，pH8.2。葡萄糖发酵用培养基。
　　脲酶，触酶(过氧化氢酶)，硝酸还原实验。
　　(2)G+Cmol％的测定
　　①DNA的提取
　　用苯酚氯仿法提取DNA，纯化DNA。收集菌体；ST液离心洗涤1～2次，2.5mL ST／g；加3mL异丙醇；加入0.1mL 5mol／L NaCl，0.26mL 0.4mol／L EDTANa2；加4倍体积 TE；加0.55g SDS，60℃水浴10min；加13mg溶菌酶，37℃，60min；100μg／mL RnaseA，37℃振摇1h，加100μg／mL proteinase K，37℃，1h；水饱和酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，10000r／min，离心15min，共6次；加等体积氯仿：异戊醇(24：1)10000r／min，离心，15分，2次；95％乙醇沉淀，异丙醇选择沉淀一次；8mL SSC溶解DNA。于260nm，280nm处测定光密度，并计算OD260／OD280。
　　②G+Cmo1％测定
　　用0.1SSC溶解DNA，定容至5mL。紫外分光光度计测定Tm得G+Cmol％。采用公式：0.1SSC G+C=(Tm-53.9)×2.44。
　　(3)菌体内有色物质鉴定
　　①细菌内有色物质鉴定
　　于牛肉膏液体培养基及加铅液体培养基上分别培养该菌株。100r／min，30℃摇床培养3d；用去离子水洗涤2次；置-10℃下冷冻。用甲醇-氯仿(1：1)法提取色素，室温融化菌体，加1OmL甲醇-4％KCl过夜，研磨后加30mL甲醇：氯仿(1：1)静置分层；取有机相。于UV-VIS spectrophotometer 756mc分光光度计上300～540nm扫描测光吸收。
　　②铅化学形态的测定
　　于加铅琼脂培养基上涂布菌体，30℃培养3d，收集菌体，无离子水洗涤，红外干燥。一部分用于WFX-16型原子吸收仪上测量菌中铅的总含量。另一部分用0.6mol／L盐酸+0.3％双氧水提取二氧化铅，草酸铅。4000r／min，离心10min，收集上层清液，定容至50mL，于WFX-16型原子吸收仪上测铅原子吸收。
　　(4)环境因子对菌株氧化铅丹的影响
　　①pH、温度对菌株氧化铅丹的影响
　　在pH分别为7.8、8.6、9.4、9.8、10.2、10.8、12的加铅培养基上涂布菌体，30℃培养7d，重蒸水离心洗涤，收集菌体。红外干燥，于WFX-16型原子仪上测铅原子吸收。
　　在加铅琼脂培养基上涂布菌体，分别于20℃、28℃、32℃、37℃培养7d。重蒸水离心洗涤，收集菌体。红外干燥，于WFX-16型原子吸收仪上测铅原子吸收。
　　②氧浓度对菌体氧化铅丹的影响
　　加铅液体培养基100mL于300mL锥形瓶中，15磅，20min，灭菌。接新鲜菌悬液8mL于瓶中，分别于正常氧浓度、纯氧气、纯氮气条件下，100r／min，30℃培养3d。以生长于正常氧气浓度下的牛肉膏液体培养基中菌体作对照。离心收集菌体，去离子水洗涤2次，红外干燥，称重。于WFX-16型原子吸收仪上测铅原子吸收。
　　③光照对菌株氧化铅丹的影响
　　于加铅琼脂培养基上涂布菌体，同时用黑纸遮光的作对照，于27～30℃自然光下培养7d。
　　(5)铅载体的测试
　　用去离子水清洗平皿，用去离子水配制琼脂培养基以及6×10(-1)mg铬黑T溶液。倒入平皿，每皿加入3mL铬黑T溶液，混匀。取1×10(6)／mL菌液0.2mL，涂布菌体；以不加菌平皿作对照，30℃培养7d，刮去菌体。
　　(6)铅在菌体内的定位
　　用套染法在透射电镜下分别观察在牛肉膏培养基及加铅琼脂培养基上生长的菌体。
　　(7)菌体的生长抑制
　　配制含Na3N的加铅琼脂培养基，使Na3N终浓度分别为10(-5)，10(-4)，10(-3)，10(-2)mol／L。每个浓度各倒3平皿，涂布0.2mL10(6)新鲜菌体，于30℃培养6d。
　　(8)质粒的消除
　　将45mg吖啶橙溶于9mL无菌水中，分别加吖啶橙溶液于5mL牛肉膏液体培养基中，使终浓度为(μg／mL)50，100，200，250，500，1000的牛肉膏液体培养基接种。30℃2培养5d。取菌悬液0.4mL，加铅琼脂培养基上培养7d。挑出丧失氧化特性的菌落，接于加铅琼脂培养基斜面，观察。
　　(9)SOD及Peroxidase的测定
　　①粗酶液的提取
　　分别于牛肉膏液体培养基及加铅液体培养基中，30℃，100r／min培养菌体4d，离心收集菌体，称重。置于-10℃过夜。室温融化，加4mL 0.1mol／L NaHCO3及3mL乙醇：氯仿／g。摇床上摇2h；10000r／min离心15min；上相加固体K2HPO4(300g／L)，搅30min；10000r／min离心15min；上相于4℃加入0.8倍冷丙酮，放5min(4℃)；10000r／min，离心15min，收集沉淀，加入1mLPBS(pH7.2)。
　　②SOD测定
　　测定体系如表6-7。
　　参比中A光照-A暗为A0，样品中A光照-A暗为A。于560nm以CK为参比测定光吸收。活力计算：
　　式中：V为反应液体积；V0为反应酶液体积；M为菌体重量；酶活力单位为在1mL反应液中，抑制NBT的光氧化达50％时的酶量。
　　③活力测定
　　测定体系如表6-8。
　　混合，按动秒表，于420nm处以空白值为参比测定吸光度，每隔20s测一次。公式为：
　　E420×3／Ew×12=μ(mg)；
　　式中：E420：420nm处吸光度的增大；3：反应混合液的总体积；12：1mg红紫培精／mL的吸光度；Ew：每0.1mL所用的酶液中含酶的重量(mg)。
　　酶单位：一个过氧化物酶单位相当于在20s内于20℃从焦棓酚催化产生1mg红紫培精时所需的酶量。
　　(二)实验结果
　　1.菌种鉴定
　　该菌为短杆状，大小为(1～1.6)μm×(1.2～2)μm，周生鞭毛，不具芽孢，具荚膜及储藏颗粒，细胞单个存在(图6-23)。呈革兰氏阴性，在牛肉膏培养基上产非水溶性黄色色素。菌落均匀、全缘、圆形、光滑、半透明，液体培养不形成菌膜，呈澄清状，具黄色沉淀。在37℃生长，耐2％NaCl，生长不需NaCl。不发酵葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、乳糖产酸。不氧化麦芽糖、蔗糖产酸。IMVIC与硫化氢试验阴性。脲酶、硝酸还原反应阴性，过氧化氢酶阳性，石蕊牛奶反应阴性。黄杆菌属见表6-9。
　　2.G+Cmol％测定
　　共得8mL 1SSC DNA溶液，260nm、280nm下光吸收值分别为1.564A、0.793A；OD260／OD280=1.972.取5mL 0.1SSC DNA液进行了Tm测定，结果见表6-10。相对吸收值的中点值为(1.108-1.015)／2+1.015=1.0615。
　　从线形图(由表6-10中数据所得)中得出中点值对应的热变性温度Tm=82.2℃
　　G+C=(82.2-53.9)×2.44=69.05mol％
　　3.菌体有色物质鉴定
　　菌体在牛肉膏培养基上呈黄色，色素溶于甲醇、氯仿等有机溶剂。在加铅培养基上，菌体呈棕黑色，棕黑色不溶于有机溶剂。用甲醇、氯仿法提取色素，二者色素均为黄色，表现标准类胡萝卜素具有的吸收曲线(图6-24)。
　　铅化学形态测定中，菌体铅总含量为4.03％，二氧化铅及草酸铅含量为2.78％，占铅总含量69.2％，见表6-11。
　　4.环境因子对菌体氧化铅丹的影响
　　在pH9.8时菌体的铅原子吸收量很高，铅原子pH吸收曲线见图6-25。菌株在20℃以下生长缓慢，在37℃时菌体氧化铅丹能力最强，如铅原子吸收温度曲线(图6-26)。
　　(1)按237页(4)③做光照对菌株氧化铅丹的影响
　　结果发现在光照条件下，菌体生长缓慢，培养基中橘红色铅丹褪色，变白(可能是形成铅白)。在黑暗的条件下，该菌生长较好，将铅丹氧化成棕黑色的PbO2，培养基呈橘红色，未见明显颜色变化(图6-27)。
　　(2)按237页(4)②测氧浓度对菌株氧化铅丹的影响
　　在加铅液体培养基中，铅原子吸收为4.03％，而在牛肉膏液体培养基中为0.05％。在纯氧及纯氮气条件下，菌体生长受抑制，仅为正常氧浓度下菌体收获量的一半。在纯氧及纯氮气条件下，菌体铅吸收与正常氧浓度下基本相似，但菌体不呈现棕黑色(表6-12)。
　　5.铅载体的测定
　　加有铬黑T的加铅琼脂培养基呈蓝紫色，其上生长的菌体呈棕黑色，刮掉菌体，看到蓝紫色培养基褪色。
　　6.铅在菌体内的定位
　　扫描电镜观察氧化了铅丹的菌体，菌体胞壁外粘附有铅颗粒，菌体内含有铅粒，菌体富含储藏颗粒，在储藏颗粒周围铅粒分布较多。
　　7.菌体的生长抑制
　　按237页(7)法，菌体在含有10(-5)mol／L NaN3的加铅培养基上呈棕黑色，生长良好。10(-4)mol／L NaN3存在情况下菌体生长不良，有部分氧化铅丹作用。在10(-3)mol／L NaN3条件下菌体几乎不长，在10(-2)mol／L NaN3条件下菌体也不生长。
　　8.质粒的消除
　　用50μg／mL吖啶橙处理后的菌体在加铅琼脂培养基上呈棕黑色，生长良好。用100μg／mL吖啶橙处理后的菌体在加铅琼脂培养基上呈淡棕色。用150μg／mL吖啶橙处理后的菌体在加铅琼脂培养基上，菌落边缘呈淡黄色，中心呈淡棕色。用200μg／mL吖啶橙处理后的菌体在加铅琼脂培养基上呈淡黄色。用500μg／mL吖啶橙处理后的菌体在加铅琼脂培养基上几乎不生长。丧失氧化特性的菌株转接到加铅斜面上，呈淡黄色(图6-28)。
　　9.SOD及Preoxidase活性测定
　　(1)SOD活性测定
　　由3.6g菌体出发，得粗酶的丙酮沉淀，用1mLPBS(pH7.2)溶解，按237页(9)法测SOD活性，在牛肉膏培养基上生长的菌体标记为Pb*，在加铅琼脂培养基上生长的菌体标记为Pb。光照3min开始出现蓝色，于560nm测定光吸收，结果见表6-13。
　　由此可以看出，在牛肉膏培养基上生长的菌体SOD粗酶活力为270.0u，在加铅琼脂培养基上生长的菌体SOD粗酶活力为295.8u。
　　(2)Preoxidase活力测定
　　丙酮沉淀得到的粗酶，用1mL PBS(pH6.0)溶解，用sigma法测定过氧化物酶的活力。在牛肉膏液体培养基上生长的菌体以Pb*表示，在加铅液体培养基上生长的菌体以Pb表示。在20℃，420nm下，20s吸光度变化见表6-14。
　　(三)讨论
　　1.菌种鉴定
　　经鉴定该菌符合黄杆菌属(Flavobacterium)的特点。黄杆菌属分为G+C为30％～40％(摩尔分数)范围及63％～70％(摩尔分数)范围的两组。里加黄杆菌及贪食黄杆菌G+Cmol％均为69。比较在本试验菌株中，同一属内的里加黄杆菌和贪食黄杆菌两相关菌种的异同，结果见表6-9。该菌与相关菌在色素、细胞大小、液体培养、淀粉水解、纤维素水解，氧化木糖、麦芽糖、甘露醇、果糖、乳糖、蔗糖产酸，伏普试验，硝酸还原试验等方面均有显著差异。
　　在新版伯杰氏鉴定手册中黄杆菌属中只保留了低G+Cmo1％含量的一组，将高DNA C+Cmol％含量的一组归入了不定种中。并且在此手册中贪食黄杆菌的G+Cmol％改为65.2。因而我们将该菌初步归入黄杆菌属不定种中。因该菌与黄杆菌中高G+Cmol％含量的相近菌株在生理生长特性上有所差异，因而初步认为是新种，命名为敦煌黄杆菌，有待DNA杂交测试，以近一步确定。
　　2.菌体有色物质的鉴定
　　菌体在牛肉膏培养基上呈黄色，在加铅培养基上呈棕色。两者色素都表现标准类胡萝卜素所具有的吸收曲线。说明在加铅培养基上菌体所呈现棕黑色不是由于色素变化引起。该棕黑色处于甲醇相中，不溶于有机溶剂，推测为无机物质。
　　进一步做了铅化学形态测定，菌体内二氧化铅及草酸铅含量为2.78％。菌体铅总含量为4.03％，前者占后者的69.2％，其中PbO2为棕色物质。由此可见在加铅琼脂培养基上菌体所呈现的棕黑色不是色素变化造成的，而是菌体将铅丹氧化成PbO2造成的。
　　3.环境因子对菌株氧化铅丹的影响
　　菌体在酸性条件下不生长，在20℃以下生长缓慢。在光照条件下几乎不生长，在37℃、pH9.8及黑暗条件下氧化铅丹程度最大。这些与菌株生长环境相符。敦煌壁画位于洞窟内，洞窟开挖较深，光线很暗，土质全部呈碱性(部分在pH8.5左右)，壁画以铅丹为主要红色颜料，这些都为敦煌黄杆菌提供了较好的生长及氧化铅丹变色的环境。
　　4.敦煌黄杆菌对铅丹的吸收
　　(1)被动吸附过程
　　在纯氧气及纯氮气条件下，菌体生长受抑制，菌体收获量仅为正常氧浓度下的一半左右。在纯氧气及纯氮气条件下，菌体铅吸收与正常氧浓度下基本相同，但菌体不呈现棕黑色。这说明，在纯氧气及纯氮气条件下菌体能够吸附铅丹，但不能氧化铅丹。同时也预示敦煌黄杆菌具有被动吸附铅的能力，但是它对铅丹的氧化不是在胞外进行的。
　　细菌对金属的固定作用有两种，金属键合到细胞壁上及胞外络合作用。金属键合到细胞壁上有三种作用机制，离子交换反应，沉淀作用和络合作用。这种作用一般在革兰氏阳性菌中常见。胞外络合作用是细菌产生某些物质并分泌到胞外时，有些物质具有吸附金属的能力。细菌产生的能够固定金属的胞外聚合物有多糖，核酸和蛋白质。这些聚合物能吸附可溶性的金属，也可用物理捕捉的方式絮凝不溶于水的金属颗粒。科学家们通过TEM观察到细菌的细胞膜及细胞壁上的酸性多聚物对细菌固定金属起重要作用。Bomstein曾用几种细菌提取的核蛋白作为废水处理的絮凝剂。这些细菌包括黄杆菌，芽孢杆菌，明串珠菌，微球菌及产碱杆菌等。
　　我们分离到的敦煌黄杆菌，虽然呈革兰氏阴性，细胞壁结构较简单，但该菌具荚膜，在电子显微镜下可看到胞外有多糖性物质，在细胞壁外附着有铅颗粒。在纯氧气及纯氮气条件下，菌体生长受抑制，但不丧失吸收铅的能力，因而，我们认为菌体对铅丹的氧化作用，是从用荚膜等胞壁外结构进行物理性絮铅颗粒开始的。
　　(2)主动吸收过程
　　王平等曾用小麦根圈细菌与FeDye(3λ)竞争Fe的方法测得小麦根圈细菌载体的存在。依据此原理，我们按237页(5)方法测定敦煌黄杆菌是否具备主动吸收铅的能力。在选择作为铅的指示剂的配体时，虽然用金属指示剂效果更佳，但用于测定铅的二甲酚橙-铅体系在pH<6.4时才起变色作用，而敦煌黄杆菌在碱性条件下才生长，所用培养基pH为8.2，所以我们选择用了单色指示剂——铬黑T。它在pH为8.2时与铅结合呈现蓝紫色。在加有铬黑T的加铅琼脂培养基上，菌体呈现棕黑色，刮掉菌体，蓝紫色的培养基褪色。说明菌体能够与铬黑T竞争吸收铅离子。证明敦煌黄杆菌在以荚膜等胞外物质物理性凝絮铅后，有主动吸附铅的过程。
　　Peterson曾研究了微球菌细胞膜上的脂类对固定铅及为铅移动到细胞其他部位提供能源起重要作用。至于敦煌黄杆菌细胞膜是否具备特定铅载体或是通过其他方式主动吸收铅还有待进一步研究。
　　(3)铅在菌体的定位
　　通过透射电镜观察，在菌体胞壁外粘附有部分铅颗粒，另一部分铅颗粒位于原生质体内。菌体具储藏颗粒，铅粒在储藏颗粒周围分布较多。有人指出，具有沉积Fe和Mn的细菌中普遍含有储藏颗粒，其中以PHB最为普遍。在敦煌黄杆菌中的储藏颗粒是否为PHB，储藏颗粒是否对菌体吸收铅有重要作用，都有待进一步研究。
　　(4)菌体吸收铅的形式
　　敦煌黄杆菌在加有铅丹的培养基上生长，并且将铅丹氧化成二氧化铅。化学工作者认为壁画上Pb3O4先在光照下转化成铅白，进而转化成PbO2。敦煌黄杆菌能够凝絮不溶性铅粒。该菌对Pb3O4氧化是否是在Pb3O4转化成铅白开始的，这个不溶性颗粒是铅丹还是铅白，在光照条件下，加铅的培养基褪色，推测为生成的铅白。但该菌在褪色的加铅培养基上几乎不生长，在黑暗条件下，加铅培养基中铅丹不褪色，菌体将铅丹氧化成棕黑色的PbO2。所以我们初步推测，附着在菌体胞壁外的铅粒不是铅白，可能是铅丹或其他形式的铅盐。
　　(5)铅丹的氧化
　　1)铅丹在胞质内被氧化
　　一般好氧菌具SOD及Catalase活性，兼性厌氧菌只具SOD，厌氧菌两者都没有。敦煌黄杆菌触酶阳性，具SOD，以及微量Preoxidase。Catalase催化分解过氧化氢生成氧和水，SOD催化O2(-)+H(+)→H2O2+O2，Preoxidase催化过氧化氢与氢供体之间的氧化反应证明敦煌黄杆菌自身代谢过程中能产生H2O2。在培养基中添加铅丹后，菌体SOD活性有所提高，这说明铅的加入促进了H2O2的消耗。在碱性条件下铅盐能够被H2O2氧化成PbO2。S.Giorannoni的工作亦认为在碱性条件下，弱氧化剂H2O2将铅白氧化成PbO2。我们在试管中用醋酸与Pb3O4反应，再加过量NaOH后，滴入少量30％H2O2，得到了与菌体在加铅培养基上所呈现颜色一致的棕黑色沉淀。所以我们认为，菌体代谢过程中产生了少量H2O2，在SOD酶作用下，将菌体吸收的铅氧化成PbO2。Dobinina曾报道Catalase介导细菌参与Mn(2+)+H2O2→MnO2+2H(+)，所以我们推测在敦煌黄杆菌内Pb(2+)+H2O2→PbO2+2H(+)可能有Catalase介导。通过氧化浓度对菌体氧化铅丹能力的影响测试，我们看到菌体被波动吸附的铅并不呈现棕黑色。而且C.Ghoiose也曾指出如果在菌体氧化代谢产生的H2O2被释放到细胞周质中去，它必会被释放出去或被非酶性物质还原，所以铅(Ⅱ)是在菌体内被氧化的。
　　2)呼吸代谢的作用
　　在纯氧气或纯氮气条件下，菌体呼吸受抑制，只能被动吸附铅丹，而不主动吸收氧化铅。这说明，呼吸代谢对于铅丹被从胞外运输到胞内，以及氧化铅丹是非常重要的。可能是呼吸代谢中产生的能量供给了铅的运输。
　　3)铅丹的氧化受质粒控制
　　通过质粒消除实验，用250μg／mL吖啶橙处理后的菌体丧失氧化铅的能力，并且此特性的丧失不可恢复，从而证明，敦煌黄杆菌氧化铅丹的能力受质粒控制。
　　综上所述，我们认为敦煌黄杆菌氧化铅丹是一个复杂且各方面参与的综合过程，初步推测其机理见表6-15。
　　5.其他
　　敦煌壁画变色是一个非常复杂的过程，以前虽然提出了变色过程，但未能解释在壁画和塑像变色的铅丹中至今尚未发现铅白这一疑点。
　　此次分离到的敦煌黄杆菌在含铅白的培养基上菌体内不生长，在黑暗条件下氧化铅丹成PbO2，其生存及氧化铅丹的环境条件与近代莫高窟壁画所处环境十分吻合，可以认为它的存在是壁画红色颜料——铅丹变色的重要原因。
　　另外，本研究采用5×10(-3)mol／mL NaN3抑制了敦煌黄杆菌在加铅培养基上的生长，今后可以应用到壁画上生物病害的防治中去。