壁画颜料中的胶结材料——反相高效液相色谱测定敦煌壁画胶结材料中氨基酸

 
　　研究敦煌壁画颜料中胶结材料的氨基酸种类、含量、现存状况，对了解壁画颜料变色的原因、壁画病害、壁画修复及古代壁画制作技术都有重要意义。柱前衍生法测定氨基酸具有快速灵敏的特点，常用的衍生试剂有邻苯二甲醛(OPA)，9-基羰酰氯(FMOC-Cl)，异硫氰酸苯酯(PITC)和丹酰氯(dansyl-Cl)等。李实用PITC柱前衍生法，紫外检测，分析了壁画胶结材料氨基酸，但PITC衍生法中，一些氨基酸如丝氨酸、苏氨酸、组氨酸的处理方法步骤复杂、时间长。FMOC-CL及Dansyl-Cl衍生法干扰大，操作复杂。邻苯二甲醛柱前衍生法操作简单，衍生反应速度快，灵敏度高。本节选用邻苯二甲醛及巯基乙醇柱前衍生法，优化分离条件，测定了敦煌壁画胶结材料水解液中15种氨基酸含量，为研究壁画提供了科学依据。
　　(一)实验
　　1.仪器与试剂
　　SHIMADZU LC-6A高效液相色谱议，RF-535荧光检测器，SCL-6A控制器(日本岛津)；CSF-A超声波清洗器(上海超声波仪器厂)；精密来酸度计；氨基酸标样(均购自Sigma公司)：天冬氨酸(Asp)，谷氨酸(Glu)，丝氨酸(Ser)，组氨酸(His)，甘氨酸(Gly)，苏氨酸(Thr)，精氨酸(Arg)，丙氨酸(Ala)，酪氨酸(Tyr)，蛋氨酸(Met)，缬氨酸(Val)，苯丙氨酸(Phe)，异亮氨酸(lle)，亮氨酸(Leu)，赖氨酸(Lys)；磷酸钠，甲醇(优级纯)，二次蒸馏水。敦煌壁画胶结材料样品(敦煌研究院提供)。
　　2.色谱分析条件
　　色谱柱Watersods C18(150×39mmi.d)，柱温：34℃；流速：1.1mL／min，荧光检测器：Ex=360nm，Em=450nm；流动相：A为0.2mol／L醋酸钠缓冲溶液，pH=6.50；B为甲醇；梯度程序：22min由100％A到80％B。
　　3.衍生试剂的配制
　　称取邻苯二甲醛0.0500g，用1mL甲醇溶解，加入100μL巯基乙醇，用0.4mol／L硼酸缓冲溶液(pH=9.5)定容至10mL，混匀，置于暗处，每三天需重新配制。
　　4.15种氨基酸标准溶液的配制
　　分别准确称取10～20mg氨基酸于25mL溶量瓶中，用pH=7.4的Na3PO4缓冲溶液定容备用。
　　5.样品前处理
　　准确称取敦煌壁画颜料试样0.1000g，置于小试管中，加入二次蒸馏水，70℃以下，溶解45min。再离心10min，使溶液与不溶固体分离。再用0.22μm微孔筛过滤上清液。将上清液移入玻璃试管中。将小玻璃试管置于三颈烧瓶中。在小玻璃试管外部加入含有1％苯酚的6mol／L盐酸。氨气保护下回流24h。再向分解后试样中加入乙醇、水和三乙胺组成的洗净液，真空干燥。样品用Na3PO4缓冲溶液溶解，定容至25mL。
　　6.衍生及分析
　　移取100μL标准溶液或样品于1mL小试管中，加入100μL衍生试剂，摇匀，反应2min。取50μL(定量环为20μL)注入高效液相色谱仪，以保留时间定性，峰面积外标法定量。
　　(二)结果与讨论
　　1.优化分析条件
　　(1)梯度程序
　　根据实验选择的洗脱梯度为：在22min内100％A到80％B，标准氨基酸衍生物得到了较理想的分离，试样中的15种氨基酸也得到了很好的分离。
　　(2)柱温
　　实验结果表明柱温在25～40℃之间分离效果较好，34℃分离最佳。
　　(3)流动相pH值
　　当pH值在5.8～6.8之间大部分氨基酸可分离，最佳为6.50。当pH偏小，氨基酸全部洗脱需35min；当PH值偏大，天冬氨酸与谷氨酸，苏氨酸与甘氨酸分不开。
　　2.结果
　　(1)标准样品在上述选择的条件下15种氨基酸分离谱图(图4-3)；敦煌壁画颜料中氨基酸分离谱图(图4-4)。
　　(2)标准氨基酸测定的保留时间、回归方程
　　在最佳实验条件下，15种氨基酸的浓度与其峰面积呈良好的线性关系，各种氨基酸测定的保留时间、回归方程、相关系数、精密度和检出限见表4-9。
　　(3)试样分析
　　根据外标法测定敦煌壁画胶结材料中氨基酸的含量，见表4-10。
　　(4)氨基酸回收率的测定
　　向已知氨基酸含量的壁画胶结材料样品中加入一定量的氨基酸混合标样，按照样品处理和分析方法测定氨基酸含量，其回收率分别为Asp98％，Glu101％，Ser99％，His96％，Gly102％，Thr102％，Arg98％，Ala97％，Tyr96％，Met102％，Val197％，Phe101％，Ile96％，Leu97％，Lys104％。